La actriz y cantante debe su apellido artístico a la escritora Gabriela Mistral (1889-1945), de la que su madre era gran admiradora. En sus comienzos, la joven Nati fue meritoria en el Teatro Español, tras cursar estudios de música, canto y declamación. Sin embargo, tuvo que salir fuera de España para que los directores se fijaran en ella. Con la compañía Los Vieneses marchó a Alemania, actuando como cantante. Fue el desaparecido Luis Escobar quien le proporcionó su primer gran éxito al contratarla en 1957 para la revista musical Te espero en Eslava. Juntos tuvieron nuevos éxitos en los años siguientes con los musicales La Bella de Texas o La Perrichola. Nati Mistral puede ser considerada la pionera de los grandes musicales en España. También protagonizó la primera versión presentada en Madrid de El hombre de la Mancha, junto a Sagi Vela.

Durante toda su carrera ha compaginado la música con el teatro, grabando canciones tan populares como Flor de té; Bajo los puentes de París; Mala entraña; Agua que no has de beber; Paisajes de Catamarca; Tata Dios; Guitarra, dímelo tú; Yo vi llorar a Dios; No soy de aquí; Bien se ve; El corralero; y La balada para un Loco. Ha cantado también una de las versiones más castizas de la zarzuela La Gran Vía.

Ha triunfado como actriz dramática en producciones de Divinas palabras, con la que se inauguró el Teatro Bellas Artes en 1961, Fortunata y Jacinta, 1969; Medea, 1970; Isabel, reina de corazones, 1983, La Chunga, 1987; Los padres terribles, 1995; La Celestina, 2001 y, más recientemente, La Dorotea, 2001; Inés desabrochada, 2004, La duda, 2006 y Tras las huellas de Bette Davis, 2007. En Buenos Aires fue empresaria de su propio teatro –el Avenida- junto al actor Alberto Closas.

Menos frecuentes han sido sus apariciones en cine, aunque ha rodado, entre otras películas, Maria Fernanda la Jerezana (1946); Las inquietudes de Shanti Andía (1947); Currito de la Cruz (1949) o Mi Buenos Aires querido (1962).